Лечение буллезного эпидермолиза и эстетическая коррекция его проявлений с помощью клеточных технологий

Алла Зорина, к. м. н., главный специалист по применению клеточных технологий Института стволовых клеток человека, г. Москва
Вадим Зорин, к. б. н., руководитель отдела регенеративной медицины Института стволовых клеток человека, г. Москва
Павел Копнин, к. б. н., заведующий лабораторией цитогенетики ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н. Н. Блохина» Минздрава России, г. Москва

Благодаря развитию методов регенеративной медицины появилась возможность эффективного лечения пациентов с врожденным буллезным эпидермолизом и значительного улучшения качества их жизни. Применение комбинации методов генной и клеточной терапии позволит восстанавливать и поврежденную кожу, и слизистые оболочки организма пациента.

Окончание. Начало статьи в № 6–7/2018 «Kрасота PROf».

Врожденный буллезный эпидермолиз (ВБЭ) – это гетерогенная группа заболеваний, при которых дермоэпидермальные связи нарушены вследствие генетически обусловленных дефектов составляющих их структурных белков. Этиопатогенетического лечения ВБЭ на сегодняшний день не существует. В связи с этим активно разрабатываются инновационные подходы к лечению ВБЭ, наиболее перспективными из которых являются генная и клеточная терапия. О генной терапии шла речь в предыдущем номере, сейчас же остановимся на возможностях клеточной терапии.

Клеточная терапия

С этой целью наиболее часто используют:
– аллогенные (донорские клетки) фибробласты кожи, выделенные, как правило, из крайней плоти;
– мультипотентные мезенхимальные стволовые (стромальные) клетки, выделенные из костного мозга (ММСКкм) здоровых доноров.

Применение фибробластов кожи

In vivo коллаген VII продуцируют как фибробласты, так и кератиноциты. Последние – в большей степени, эти клетки являются основным источником коллагена VII для базальной мембраны. Однако фибробласты по сравнению с кератиноцитами культивируются значительно легче, поэтому именно фибробласты являются клетками выбора для клеточной терапии пациентов с ВБЭ.

Фибробласты – основные клетки соединительнотканной основы кожи, обеспечивающие ее гомеостаз и морфофункциональную организацию – ключевое звено биологии кожи. В дерме они продуцируют различные типы коллагена (I, III, IV, V, VI, VII), эластические волокна, матриксные металлопротеиназы, гликозаминогликаны, гликопротеины, факторы роста/цитокины.

Формируемая фибробластами строма образует физический каркас, служащий опорой для эпителия, а также играет регуляторную роль в определении структуры и функций эпителиальных клеток. Продуцируя множество проангиогенных факторов (VEGFs, FGFs, TGF-β1, HGF/SF и ангиопоэтин-1), фибробласты кожи активно участвуют в ангиогенезе. За счет секреции факторов роста (KGF-1, GM-CSF), интерлейкинов IL-6, IL-8 и за счет непосредственного взаимодействия с эпителиальными клетками фибробласты играют ключевую роль в регуляции эпидермального морфогенеза. Продуцируя коллаген IV типа и ламинин, они влияют на формирование базальной мембраны. Продуцируя коллаген VII типа, участвуют в формировании якорных волокон и ДЭС.

Фибробласты кожи легко культивируются, сохраняют диплоидный кариотип, имеют ограниченную продолжительность жизни, не экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости класса II, не проявляют онкогенных свойств. Их биосинтетическая активность сохраняется после трансплантации в дерму. Вышеописанные свойства фибробластов подтверждают, что именно эти клетки могут служить основной составляющей для клеточной терапии пациентов с ВБЭ.

Исследования, проведенные на гипоморфных по С7 мышах (этих мышей используют в качестве модели заболевания РДБЭ, так как их клетки экспрессируют не более 10% от нормального уровня синтеза коллагена), показали, что внутрикожное введение таким животным фибробластов кожи человека способствует повышению содержания С7 и якорных фибрилл в области ДЭС и, соответственно, способствуют заживлению кожных ран.

Полученные в доклинических исследованиях данные послужили основанием для проведения клинических исследований с использованием аллогенных фибробластов кожи для лечения пациентов с РДБЭ. В 2008 году проведенные на пяти таких пациентах исследования показали, что при однократном введении аллогенных фибробластов кожи у большинства пациентов наблюдается увеличение экспрессии COL7A1 как минимум в течение трех месяцев и, соответственно, заживление ран. Клеточный материал вводили внутрикожно по краям раны и в прилегающую к ней кожную ткань. Подтвердилось, что аллогенные фибробласты кожи обладают низкой иммуногенностью, их введение не сопровождается какой-либо патологической реакцией со стороны организма пациента. Дальнейшее клиническое исследование выявило, что однократное внутрикожное введение аллогенных фибробластов кожи способствует увеличению экспрессии COL7A1 в течение трех-шести месяцев, а продукция C7 наблюдается в течение 9–12 месяцев. При этом транскриптомный анализ серии биоптатов кожи этих пациентов показал увеличение продукции гепарин-связывающего фактора роста HB-EGF (подобного эпидермальному), коррелирующее с повышением экспрессии COL7A1. Следует отметить, что аллогенные фибробласты кожи в месте введения не определяются уже через две недели после их внутрикожного введения.

По всей видимости, трансплантированные фибробласты кожи за счет паракринного эффекта индуцируют повышение продукции резидентными клетками кожи (фибробластами и кератиноцитами) фактора роста HB-EGF, который, в свою очередь, усиливает экспрессию COL7A1 в этих клетках, что способствует стойкому увеличению продукции С7. Согласно гистологическим исследованиям, образованный de novo C7 имеет «реципиентское» происхождение – мутантный, но сохраняющий частичную функциональность. Аллогенные фибробласты кожи, как выяснилось, после трансплантации в дерму сами также продуцируют С7, который встраивается в ДЭС, но процесс этот кратковременный – не более двух недель, пока трансплантированные клетки присутствуют в коже.

Результаты рандомизированного плацебо-контролируемого двойного слепого клинического исследования у пациентов с ДРБЭ, проведенного с использованием аллогенных фибробластов кожи, также продемонстрировали хороший клинический эффект. У большинства пациентов реэпителизация наблюдалась в течение первых 28 дней, полученный результат сохранялся не менее шести месяцев. Не зарегистрировано ни одного побочного эффекта и нежелательного явления. При этом отмечено значительное снижение эритемы и улучшение качества жизни пациентов, в том числе и за счет сокращения времени на ежедневную рутинную обработку ран. Длительность и выраженность клинического эффекта, по мнению исследователей, может быть связана с уровнем экспрессии COL7A1.

Клетки, выделенные из костного мозга

По мнению ряда исследователей, эффективным методом для лечения пациентов с РДБЭ может служить применение мультипотентных мезенхимальных стволовых (стромальных) клеток, выделенных из костного мозга (ММСКкм) здоровых доноров.

ММСК обладают мультипотентным дифференцировочным потенциалом, включая способность к  дифференцировке в фибробласты (и, возможно, в кератиноциты), способностью продуцировать компоненты внеклеточного матрикса и факторы роста/цитокины – трофические факторы, усиливающие миграцию, пролиферацию и дифференцировку эндогенных клеток-предшественников, а также неоваскуляризацию ткани. Они обладают гипоиммуногенностью, не экспрессируют MHC II, что обеспечивает безопасность их аллогенной трансплантации.

ММСК имеют также следующие характеристики:
– выраженные противовоспалительные свойства;
– способность мигрировать в места повреждения, продуцируя при этом различные иммуномодуляторные факторы, влияющие на поведение дендритных и Т-клеток, натуральных киллеров;
– способность снижать В-клеточную пролиферацию, созревание моноцитов, секрецию IFN-g и TNF-a, одновременно с тем усиливать индукцию Т-регуляторных клеток и секрецию антивоспалительных IL-10 макрофагами при непосредственном контакте последних с ММСК.

Результаты доклинических исследований, проведенные на иммунодефицитных мышах, показали, что трансплантация ММСКкм человека как локально, так и системно безопасна, наблюдается реэпителизация и заживление кожных ран. Ученые на «мышиной» модели RDEB (COL7A1 mice) продемонстрировали, что внутривенно введенные ММСКкм способны мигрировать в кожу и слизистые оболочки и увеличивать продукцию С7 и образование якорных волокон, а соответственно, и способствовать заживлению кожных ран.

Полученные данные послужили основанием для проведения клинического исследования с целью изучения возможности трансплантации данных клеток при лечении пациентов с РДЭБ. Предполагается, что ММСКкм мигрируют в зоны повреждений, где, оказывая паракринный эффект, способствуют заживлению ран кожи и слизистых оболочек организма.

Существует также мнение, что данные клетки способны дифференцироваться в фибробласты и кератиноциты. Некоторые ученые полагают, что популяция ММСКкм включает субпопуляцию эпителиальных клеток-предшественников, которые и производят регенеративный эффект. Исследования в этом направлении продолжаются.

Ограниченное плацебо-контролируемое клиническое исследование на двух пациентах с РДБЭ (подтип OMIM 226600), которым внутрикожно трансплантировали аллогенные ММСКкм в интактную и поврежденную кожу, показало, что через неделю de novo образованный С7 регистрировался в области базальной мембраны и ДЭС кожи, в местах введения клеток наблюдалась реэпителизация хронических ран. У обоих пациентов отмечено заметное клиническое улучшение, которое наблюдалось в течение четырех месяцев. Не выявлено ни одного местного или системного побочного эффекта. Результаты исследования говорят о том, что интрадермальное введение аллогенных ММСКкм может способствовать экспрессии COL7A1, увеличению уровня C7 в области ДЭС, а также предотвращению образования пузырей и заживлению ран у пациентов с РДБЭ.

В 2016 году были представлены результаты рандомизированного двойного слепого клинического исследования, проведенного с целью изучения эффективности системного (внутривенного) введения ММСКкм 14 пациентам с РДБЭ. Некоторым пациентам (при особенно тяжелых поражениях кожи) ММСКкм вводили и интрадермально. Срок наблюдений – один год. Результаты выявили у всех пациентов клиническое улучшение. Отмечено снижение количества пузырей, не регистрировалось появление новых; при гистологическом исследовании биоптатов кожи отмечено увеличение содержания якорных волокон. Побочных эффектов не было.

Исследователи заключили, что трансплантация аллогенного ММСКкм (как системно, так и внутрикожно) безопасна и клинически эффективна (у двух пациентов выраженный клинический эффект был получен к концу первого года после инфузии ММСКкм, у остальных – через три месяца).

По мнению ученых, ежегодные реинфузии ММСКкм могут служить оптимальным методом для поддержания хорошего качества жизни у пациентов с РЭБД. Они подчеркнули, что в особо тяжелых случаях внутривенное введение следует сочетать с интрадермальным введением этих клеток.

Результаты еще одного исследования с участием десяти детей с РДБЭ также оптимистичны. Детям трехкратно (в 0-й, 7-й и 28-й дни лечения) выполнена внутривенная трансплантация ММСКкм. При этом инфузию ММСКкм осуществляли в течение десяти минут, через час пациенты возвращались к обычному образу жизни. Трехкратное введение аллогенных ММСКкм не вызывало никаких побочных эффектов. После третьей инфузии клеток практически у всех пациентов отмечен выраженный клинический эффект, который проявлялся в заживлении ран, редукции образования пузырей и эритемы кожи, уменьшении болевой реакции. Пациенты отметили улучшение общего состояния, включая нормализацию сна и повышение качества жизни. Клинический эффект сохранялся не менее года.

Учитывая собственные результаты и клинический опыт других исследователей, авторы заключают, что однократная внутривенная трансплантация аллогенных ММСКкм каждые шесть месяцев может служить эффективным методом лечения пациентов с РДБЭ.

Заключение

Таким образом, представленные результаты клинических исследований позволяют сделать вывод, что благодаря развитию методов регенеративной медицины – клеточной и генной терапии – у пациентов с ВБЭ появилась возможность эффективного лечения этого изнуряющего заболевания и значительного улучшения качества жизни.

Есть основания полагать, что наиболее оправданным подходом будет применение комбинации методов генной и клеточной терапии, что позволит восстанавливать и поврежденную кожу, и слизистые оболочки организма пациента.

 

Полная печатная версия:
Архив...